تنوع زیستی و فیلوژنی گونه های فوزاریوم مرتبط با سنبله گندم و خویشاوندان وحشی آن در استان اردبیل با توالی یابی چند ژنی

شیوع بیماری سوختگی فوزاریومی سنبله گندم (fhb) در استان اردبیل در چند سال اخیر روند افزایشی داشته و منجر به ایجاد خسارت اقتصادی به این محصول راهبردی از طریق کاهش عمکلرد و تولید زهرابه های قارچی شده است. به منظور بررسی تنوع زیستی گونه های فوزاریوم مرتبط با سنبله گندم و خویشاوندان وحشی در استان اردبیل، سنبله-های مبتلا به بیماری fhb گندم و گل آذین های گندمیان وحشی طی سال های 1388 و 1389 از منطقه گندم خیز مغان جمع آوری و پس از جداسازی قارچ های متعلق به جنس fusarium با استفاده از محیط های کشت اختصاصی و عمومی و خالص سازی با روش تک اسپور کردن از روی ویژگی های ریخت شناختی مورد شناسایی اولیه قرار گرفتند. برای مطالعات مولکولی، سه ژن tef-1?، rpb2 و its-rdna از کلیه جدایه ها توالی یابی شدند و پس از مقایسه با توالی های موجود در genbank و پایگاه داده اختصاصی fusarium-id با استفاده از ابزار جستجویblast توالی های با بیشترین مشابهت دریافت شدند. رج بندی توالی ها و رسم درخت فیلوژنتیکی با استفاده از نرم افزار mega5 انجام شد. بر اساس نتایج، 1/97 درصد از جدایه های به دست آمده از سنبله های بیمار گندم متعلق به کمپلکس گونه ای fusarium graminearum و بقیه جزو کمپلکس گونه ای f. incarnatum-equiseti بودند. از 23 گونه گرامینه وحشی 15 گونه متعلق به شش کمپلکس گونه ای فوزاریوم به دست آمد که بیشترین فراوانی به ترتیب مربوط به گونه های f. incarnatum، f. equiseti، f. graminearum s. str. و f. proliferatum بود. در بین این گونه ها، گزارش و توصیف چهار گونه f. brachygibbosum، f. torulosum، f. commune وf. cf. reticulatum var. negundis برای ایران جدید می باشد و تعدادی از این گیاهان به عنوان میزبان جدید گونه هایی از جنس فوزاریوم در دنیا گزارش می شوند. همچنین به منظور مقایسه گونه های مولد بیماری fhb بین منطقه مغان و مناطق شمالی کشور، تعداد 27 جدایه به دست آمده از سنبله های بیمار گندم از نواحی مختلف استان گلستان نیز به همراه جدایه های مغان با استفاده از داده های ریخت شناختی و مولکولی به ترتیب بالا مورد شناسایی قرار گرفتند و بر این اساس، با شناسایی هشت گونه فوزاریوم، تنوع زیستی بالایی در بین جدایه های شمال مشاهده شد کهf. graminearum s. lato بالاترین فراوانی را در استان گلستان به خود اختصاص می داد. گونه مرکب f. graminearum senso lato تاکنون به عنوان گونه غالب در ایجاد این بیماری در اکثر مناطق گندم کاری دنیا از جمله ایران معرفی شده است. این گونه در حال حاضر بر اساس اطلاعات فیلوژنتیکی حداقل به 15 گونه فیلوژنتیکی تقسیم شده است ولی تاکنون اطلاعات کافی از این تقسیم بندی جدید در ایران وجود نداشت. بنابراین در بخش دوم این تحقیق، به منظور شناسایی هم زمان گونه های فیلوژنتیک و تیپ شیمیایی، 139 جدایه متعلق به کمپلکس گونه ای f. graminearum (fgsc) به دست آمده از منطقه مغان و استان گلستان با استفاده از روش تدوین ژنوتیپ چند ژن گاهی (mlgt multilocus genotyping,) با فناوری لومینکس بررسی شدند. در این فناوری، 41 کاوشگر برای تشخیص هم زمان دودمان های شناخته شده در این کمپلکس و پنج گونه نزدیک و زهرابه های قارچی عضو گروه تریکوتسن b استفاده می شود. نتایج پژوهش نشان داد که تمام جدایه ها متعلق به f. graminearum sensu stricto (lineage 7) هستند و فقط چهار جدایه منطقه مغان با هیچ کدام از دودمان های شناخته شده داخل این کمپلکس مطابقت نشان ندادند و احتمالا دودمان جدیدی را داخل fgsc تشکیل دهند. همچنین طبق نتاج لومینکس،6/97 درصد جدایه های منطقه مغان متعلق به تیپ شیمیایی 15adon و بقیه متعلق به 3adon بودند، در حالی که در استان گلستان، دو تیپ شیمیایی niv و 3adon به ترتیب 7/91 و 3/8 درصد جدایه ها را تشکیل می دادند. تمام جدایه های fgsc به دست آمده از گل آذین گندمیان وحشی منطقه مغان نیز متعلق به f. graminearum s. str. و تیپ شیمیایی 15adon بودند. آگاهی دقیق از گونه های فیلوژنتیک و تیپ های شیمیایی جنس فوزاریوم می تواند در تولید ارقام مقاوم و سایر روش های مدیریتی بیماری fhb در هر منطقه مد نظر قرار گیرد. در بخش سوم این تحقیق با توجه به برخی مشکلات موجود در شناسایی مبتنی بر ریخت شناسی و نیز هزینه بالا و عدم دسترسی آسان به روش های مطمئن مانند توالی یابی، کارآیی رهیافت rca (rolling circle amplification) یا تکثیر دایره غلتان که در شناسایی گونه برخی بیمارگرهای انسانی در چند سال اخیر مورد استفاده قرار گرفته است، در شناسایی فوزاریوم بررسی گردید. rca روشی سریع، حساس، مقرون به صرفه و بدون نیاز به توالی یابی است که در آن از کاوشگرهای قفلی (padlock probe) استفاده می شود و محصول تکثیر یافته به راحتی روی ژل آگاروز قابل مشاهده است. برای این منظور، کاوشگر قفلی اختصاصی fgsc بر اساس چندشکلی ناحیهtef-1? پس از رج بندی بیش از 100 توالی فوزاریوم ایرانی و توالی های برگرفته از بانک ژن متعلق به کمپلکس های گونه ای مختلف از جمله fgsc طراحی گردید. سپس حدود 65 جدایه متعلق به گونه های مختلف شامل کمپلکس گونه ای fg و حدود 40 جدایه متعلق به جنس های نزدیک به فوزاریوم انتخاب و پس از تکثیر ناحیه tef-1?، آمپلیکون ها با استفاده از رهیافت rca مورد ارزیابی قرار گرفتند. با بررسی نتایج روی ژل آگاروز و نیز زیر نور uv معلوم شد که کاوشگر fgsc به صورت اختصاصی dna هر 15 دودمان شناخته شده در داخل این کمپلکس را تکثیر داده و هیچ واکنشی با گونه های متعلق به سایر کمپلکس های فوزاریوم و یا سایر جنس های قارچی مورد بررسی نشان نداد. به منظور راست آزمایی بیشتر کارآیی rca در شناسایی صحیح گونه ها، این رهیافت در مورد 50 جدایه فوزاریوم به دست آمده از سنبله های گندم و گندمیان وحشی شمال و شمال غرب ایران مورد آزمایش قرار گرفت و مطابقت کامل بین تشخیص rca و نتایج ریخت شناختی و توالی-یابی مشاهده شد. این تحقیق اولین مطالعه از شناسایی تنوع گونه های فوزاریوم همراه با گل آذین گندمیان وحشی، شناسایی گونه های متعلق به جنس فوزاریوم با استفاده توأم از داده های ریخت شناختی و توالی یابی و بررسی گونه های داخل کمپلکس fg و تیپ های شیمیایی آن با روش mlgt در ایران است. همچنین برای نخستین بار در دنیا استفاده از روش rca در تشخیص گونه های یک قارچ بیمارگر گیاهی معرفی می شود.